project

High-throughput qPCR

Expert(s):
ing. Leo Heijnen, prof.dr. Gertjan Medema

  • Startdatum
    01 jan 2019
  • Einddatum
    31 dec 2019
  • Opdrachtgever
    Bedrijfstakonderzoek
  • samenwerkingspartner(s)

Steeds meer snelle, zogenoemde ‘high-throughput qPCR’-methoden komen beschikbaar voor het gelijktijdig detecteren en identificeren van grote hoeveelheden genen. In dit onderzoek wordt getest hoe een aantal kansrijke methoden zich verhouden tot reeds bestaande qPCR-methoden waarvan KWR gebruikmaakt, met een focus op antibioticaresistentiegenen in water. Gekeken wordt naar toepasbaarheid, kwaliteit, mogelijkheden en kosten.

High-throughput versus conventionele qPCR

De ontwikkelingen van moleculaire methoden voor detectie en typering van micro-organismen gaat razendsnel. Een aantal jaar geleden werd nog voor elke bacterie een aparte (q)PCR methode gebruikt; nu werkt men met high-throughput qPCR, waarmee veel bacteriesoorten, -typen en -genen tegelijk zijn te analyseren. Deze ontwikkeling, waarbij de activiteit van heel veel genen gelijktijdig kan worden gescreend, wordt vooral gedreven vanuit de medische en farmaceutische wetenschappen. Ook vindt toepassing plaats in klinische labs voor het screenen van patiëntmateriaal op heel veel bacteriegenen of antibioticaresistentiegenen.

Leveranciers van diagnostische testen ontwikkelen tegenwoordig testsystemen en/of platformen waarmee bijvoorbeeld in één enkel monster tientallen tot honderden resistentiegenen of ziekteverwekkers kunnen worden gescreend. In de drinkwatersector, waar gedurende afgelopen jaren eveneens veel (individuele) qPCR methoden zijn ontwikkeld, zien we nu de behoefte om met het oog op resistentiegenen de screeningscapaciteit op te voeren. Als high-throughput qPCR goed blijkt te werken op (concentraten van) watermonsters, komt hiermee een methode binnen handbereik waarmee een groot array aan bijvoorbeeld ziekteverwekkers, indicatororganismen en source tracking markers gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd.

Binnen de watersector bestaat een acute vraag naar het gelijktijdig kunnen screenen van veel resistentiegenen. Daarom richten we ons met dit doel op het binnenhalen en testen van de high-throughput qPCR methode binnen dit kraamkamerproject. Bovendien brengen leveranciers al testplatformen voor deze methode op de markt die passen bij onze huidige apparatuur en hebben we referentiemethoden in huis waarmee we de high-throughput qPCR kunnen vergelijken. Meer inhoudelijk worden zowel prefab platformen – met door de leverancier bepaalde resistentiegenen die worden getest – als open platformen – met een vrije keuze in het testen van resistentie en andere genen – onderzocht op toepasbaarheid, kwaliteit, mogelijkheden en kosten.

Diverse methoden selecteren en testen

Allereerst bepalen we op grond van de literatuur welke klinisch relevante antibioticaresistentiegenen en mobiele genetische elementen in water worden aangetroffen en dus idealiter in het platform aanwezig zijn. Daarnaast worden in dit overzicht ook integrons en controles zoals 16S gen (generiek) meegenomen.

Vervolgens kijken we aan de hand van wetenschappelijke literatuur en met informatie van leveranciers welke platformen relevant en beschikbaar zijn om een serie resistentiegenen met high-throughput qPCR te kunnen detecteren. In eerste instantie richten we ons hierbij op platformen die geschikt zijn voor de BioRAD qPCR CFX96 thermocyclers waarover KWR beschikt. Tijdens deze inventarisatie richten we ons op het aantal relevante resistentiegenen en mobiele elementen, te onderzoeken volume, kwaliteitscontrole, leverancier, kosten, referenties van gebruik in klinisch en/of water/milieu/voedselonderzoek.

In de volgende fase voeren we testen uit met een of meer platformen voor high-throughput qPCR-systemen die op grond van het voorgaande zijn geselecteerd. Gebruik wordt gemaakt van bacteriën die drager zijn van bekende, specifieke resistentiegenen. Zo nodig wordt voor deze resistente bacteriën kweekmethoden in huis gehaald. Met de high-throughput qPCR wordt onderzocht of en met welke gevoeligheid het DNA van de betreffende bacteriën kan worden aangetoond. Daarnaast wordt DNA uit rioolwatermonsters geëxtraheerd om met high-throughput qPCR te bepalen welke resistentie- en mobiele genen hierin aanwezig zijn. Vervolgens worden verschillende verdunningen van bacteriecultures aan rioolwater toegevoegd waarvan de resistentiegenen bekend zijn. Door dit ‘gespikete’ rioolwater daarna met high-throughput qPCR te onderzoeken, kan worden vastgesteld of en tot welke verdunning de bekende resistentiegenen hierin zijn terug te vinden. Voor de genoemde procedure wordt een gedetailleerd protocol uitgewerkt. Indien mogelijk en opportuun worden ook biofilmmonsters onderzocht, op dezelfde wijze als de rioolwatermonsters.

Evaluatie van toepassingspotentie

Dit kraamkamerproject heeft tot doel om voor het BTO en de waterbedrijven en laboratoria de toepassingspotentie van high-throughput qPCR te evalueren. Daarmee vormt het een volgende stap in de ontwikkeling van DNA-gebaseerde detectiemethoden. Gezien de potentie van high-throughput qPCR om tientallen tot zelfs honderden DNA-targets tegelijkertijd te kunnen analyseren, komt hiermee een nieuwe generatie waterkwaliteitsbewakingsmethoden binnen handbereik om met één analyse een hele range aan relevante microbiologische parameters te bepalen.