project

Voorbereiding RT-PCR-methode enterococcen

Expert(s):
ing. Leo Heijnen, ing. Ronald Italiaander

  • Startdatum
    21 nov 2019
  • Einddatum
    31 dec 2020
  • Opdrachtgever
    Bedrijfstakonderzoek
  • samenwerkingspartner(s)
    Expertgroep RT-PCR (omvat NL drinkwaterlabs, De Watergroep, PIDPA, Water-Link en RIVM

Het routinematig bepalen van de veiligheid van ons drinkwater is van groot belang. Hiervoor wordt in de praktijk een kweekmethode gebruikt voor de darmbacteriën E. coli en enterococcen. Het uitvoeren van deze methode kost in de praktijk ruim twee dagen. De wens is om voor enterococcen een geaccepteerde snelle methode te ontwikkelen, net zoals eerder is gedaan voor E. coli. Deze RT-PCR-methode voor E. coli is recent goedgekeurd door het ministerie van Infrastructuur en Waterstaat en geeft binnen enkele uren resultaat.

Gevoeliger en sneller

De detectie van E. coli en enterococcen is een goede maat voor de veiligheid van ons drinkwater. Bij onderhoud en calamiteiten is het van belang dat het drinkwater snel kan worden gecontroleerd op de mogelijke aanwezigheid van deze bacteriën. Het voordeel van de RT-PCR-methode is dat deze binnen een halve dag uitsluitsel kan geven over de veiligheid van het drinkwater. Deze methode maakt gebruik van PCR-technieken op RNA-moleculen. Deze RNA-moleculen zijn in grotere aantallen aanwezig in actieve micro-organismen dan in niet actieve micro-organismen. Daarmee is deze methode gevoeliger dan moleculaire methoden waarbij op DNA-niveau gekeken wordt. De DNA-gebaseerde methode geeft namelijk geen informatie over de mate van activiteit van de micro-organismen. Om vast te stellen of de RT-PCR-methode geschikt is als alternatief voor de kweekmethode, is een reeks aan onderzoeken gedaan wat heeft geleid tot een wettelijk geaccepteerde RT-PCR methode voor E. coli.

RT-PCR detectiemethode voor enterococcen

Enterococcen zijn een diverse groep bacteriën, met onder andere de darmbacterie E. coli. Binnen deze groep komen tientallen soorten voor, waarvan een aantal met een rol in hygiëne en gezondheid. Daarom is het belangrijk dat de RT-PCR-methode de enterococcen die relevant zijn voor drinkwater kan detecteren. Om dit te bepalen is in het laboratorium een mengsel van een tiental bekende enterococcen samengesteld. Daarmee kan de gevoeligheid van de nieuwe RT-PCR-methode en de klassieke kweekmethode met elkaar worden vergeleken.

Het gebruik van tien verschillende enterococcen vereist optimalisatie van de RT-PCR. In de eerste stap wordt het RNA omgezet naar DNA voor het uitvoeren van de PCR-reactie. Vervolgens worden korte DNA-fragmenten (primers) gebruikt, die uniek zijn voor verschillende enterococcen-soorten. Voor de tien onderzochte enterococcen is een drietal primers en daarmee een drietal RT-PCR-reacties nodig. Voor een nog efficiëntere detectie wordt daarom gewerkt aan een methode waarbij deze drie RT-PCR-reacties in één keer uitvoerbaar zijn.

Snellere veiligheidsbepaling

Dit BTO-onderzoek vindt plaats in het kader van biologische veiligheid en het sluit aan bij bedrijfsonderzoek naar sneller meten na werkzaamheden. Omwille van tijdwinst zijn na werkzaamheden een snelle detectiemethode in combinatie met snel meten van cruciaal belang. Met de RT-PCR-methode kunnen drinkwaterbedrijven een versnelde veiligheidscontrole uitvoeren, zodat klanten snel weer drinkwater kunnen gebruiken.

Overzicht van de procedure voor de klassieke kweekmethode (links) en de nieuw ontwikkelde snelle RT-PCR-methode (rechts).